Polysciences 24765-1試劑

一、貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染：Polysciences 24765-1試劑

以293T細(xì)胞為例，需要精確控制轉(zhuǎn)染條件以確保*高效率。以下是具體步驟：

細(xì)胞準(zhǔn)備：

使用膠原酶處理細(xì)胞并計數(shù)。在6孔板中以每孔2×106細(xì)胞接種。每孔加入2 mL新鮮的DMEM/F12+5%FBS 培養(yǎng)基和1 mL的細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后,移除之前培養(yǎng)基，每孔加入2 mL新鮮的DMEM/F12+5%FBS。

轉(zhuǎn)染過程：

1.檢查細(xì)胞匯合度，達(dá)到70%-80%時開始轉(zhuǎn)染。

2.分別用兩份100 µL無血清培養(yǎng)基稀釋DNA，使DNA終濃度為1 µg/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）和適當(dāng)比例的適量Polysciences 24765-1。DNA:PEI 的比例要依據(jù)自己實驗摸索最適比例。

3.將稀釋的Polysciences 24765-1轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒（總體積200 µL）輕輕混勻，室溫孵育30 分鐘。

4.PEI-DNA 復(fù)合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板每個孔中，輕搖混勻。注意輕輕沿著孔板邊緣滴入，以免破壞細(xì)胞的粘附性。

5.將培養(yǎng)板放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h。

結(jié)果觀察：

在24小時后使用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，超過80%的293T 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的24 h可以觀察到綠色熒光。

二、懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染：Polysciences 24765-1試劑

懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟略有不同，小規(guī)模轉(zhuǎn)染時，用新鮮的培養(yǎng)基重懸浮，使細(xì)胞密度達(dá)到 1×106cells/mL，如需大規(guī)模轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度要到達(dá)2-3×106cellsml/mL。

以293F細(xì)胞為例：

細(xì)胞準(zhǔn)備：

傳代接種于20 mL 懸浮細(xì)胞生長培養(yǎng)基中(36.5℃，120 rpm，5%CO2 )培養(yǎng)細(xì)胞至1×106 cells/mL的密度，旋緊瓶口放入搖床，2~4 小時后可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染過程：

1.用1 mL無血清培養(yǎng)基稀釋適量的DNA，使DNA 終濃度為1 µg/ml，混勻并靜置5 min。

2.用1 mLOptiPRO

SFM(無血清培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的PEI 40000，混勻并靜置10 min。

3.將稀釋的24765-1轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒輕輕混勻，室溫孵育30分鐘。

4.將PEI-DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，搖勻后旋緊瓶口放回?fù)u床（36.5℃，5%CO2，120 rpm）。

5.基因表達(dá)可在24-72小時后檢測，時間取決于細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因。